Los resultados de las pruebas serológicas para auto-anticuerpos, incluyendo la de anti-nucleares (ANA) y anticuerpos contra antígenos específicos como ser anti DNA de doble cadena, son muy importantes en el diagnóstico de enfermedades reumáticas sistémicas.
Muchas veces estos resultados pueden ser mal interpretados. Muy pocos de estos anticuerpos son patognomónicos para una enfermedad autoinmune reumática sistémica particular, como muchas veces los anticuerpos anti-virales sí lo son para enfermedades infecciosas. Por estas razones el resultado de una prueba de ANA aislada es insuficiente para establecer un diagnóstico.
Resultados positivos son encontrados en pacientes sin patolo犀利士
gía reumática y aún en individuos jóvenes normales. Por lo tanto muchas consideraciones técnicas son críticas para la correcta interpretación de los resultados, evitando así errores diagnósticos, terapias inapropiadas y un mal aprovechamiento de los recursos económicos en salud.
Microscopio
Las lámparas pueden ser Halógenas o de Mercurio de distintas potencias (50 o 100 w).
La comparación de la intensidad de la fluorescencia requiere del uso de estándares fluorescentes que tengan el mismo espectro que el de los sustratos utilizados en los distintos estudios de inmunofluorescencia. Estos estándares fluorescentes son portaobjetos comerciales que contienen microesferas fluorescentes con distintas intensidades que permiten monitorear diariamente el comportamientodel microscopio. Permite chequear la sensibilidad de la lámpara controlando el desgaste de la misma, la uniformidad del campo de iluminación y la estabilidad de la fuente.
Recolección y Almacenamiento de las Muestras
La determinación debe hacerse en suero. La muestra puede ser refrigerada a 4°C si la determinación se realizara dentro de las 72 hs. Si la determinación se realizara después de las 72 hs, el material debe ser refrigerado a -20°C o menos. Sucesivas congelaciones y descongelaciones puede alterar el resultado.
Elección del Sustrato
El sustrato más ampliamente recomendado es la HEp-2. Al no conocer el fijador utilizado y debido a que alguno de ellos, como ser etanol o metanol, no fijan antígenos como el SSA/Ro, es aconsejable agregar un control positivo para este anticuerpo.
Conjugado Fluorescente
Habitualmente el anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas utilizado se marca con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Existen algunas consideraciones con respecto a la elección del conjugado como ser: elección de la especificidad isotípica del conjugado, relación Fluoresceína/ Proteína (F/P), relación anticuerpo específico / proteína (Ac esp/Pr) y dilución de trabajo.
Especificidad Isotópica del conjugado:
En la determinación de AAn por IFI pueden ser usados tanto conjugados polivalentes (reactivos contra IgG, IgA e IgM) como conjugados anti-IgG específicas. El 96% de los pacientes con LES producen AAn de clase IgG. Si se utiliza un conjugado IgG específico no podrán ser detectados los AAn de clase IgM asociados con la artritis reumatoidea, drogas o la edad. Sin embargo, un 4% de los pacientes con enfermedades reumáticas sistémicas producen cantidades significativas de AAn IgM específicas.
Relación F/P: se recomienda que la relación F/P sea aproximadamente 3.0. Si la relación F/P es mayor aumentará la tinción fluorescente no específica, por otro lado si la relación F/P es menor disminuirá mucho la fluorescencia específica obteniendo resultados falsos negativos.
Relación Ac esp/Pr: debe ser aproximadamente 0.1 o mayor.
Dilución de trabajo del conjugado: el método más aceptado de titulación del conjugado es el de titulación en damero o tablero de ajedrez. Se debe contar con un suero de referencia o patrón primario o en su defecto un patrón secundario de título conocido, y de un suero negativo conocido.
La dilución óptima de trabajo del conjugado debe establecerse bajo las siguientes circunstancias:
Cada vez que se use un nuevo lote de conjugado
Si se cambia el sustrato (incluso la marca del sustrato)
Si se cambia el sistema óptico de lectura o al cambiar la lámpara.
Rango de Referencia
Se debe establecer el intervalo de referencia en pacientes normales según la edad, teniendo en cuenta el sexo.
Como recomiendan los trabajos internacionales se considera como dilución de corte 1:80 con el objeto de tener en cuenta a los pacientes lúpicos que presentan bajos títulos y recordando que la interpretación del resultado debe hacerse en un contexto clínico adecuado.
Nomenclatura e Informes de Resultados
Esta determinación debe ser considerada semicuantitativa, informando la dilución a punto final. De ser un resultado positivo se debe informar el título y el patrón fluorescente observado, nuclear homogéneo, granular, etc., incluyendo, de observarse, el patrón citoplasmático y el aparato mitótico. En nuestro caso, nos basamos en el International Consensus on Antinuclear Antibody (ANA) Patterns (ICAP).
Recomendaciones
Definición de resultado negativo: un resultado se considera negativo cuando no se discrimina un patrón fluorescente definido. Se debe tener en cuenta que la no determinación de anticuerpos en la prueba no implica ausencia de enfermedad. Esto puede deberse a la baja concentración del antígenos en el sustrato, como sucede con el antígeno SSA/Ro. Resultados negativos pueden observarse en pacientes con síndrome de Sjogren, polimiositis, artritis reumatoidea, esclerodermia y en un subgrupo de pacientes con LES considerados AAn negativos – SSA/Ro positivos con características clínicas particulares. Ante un resultado negativo, si aún existe una sospecha de una enfermedad autoinmune reumática sistémica hay que investigar la presencia de anti-SSA/Ro, anti-Ribosomal P y anti-Jo-1 por ELISA u otro método específico.
Definición de resultado positivo: un resultado debe ser considerado positivo cuando se observa una prueba reactiva por encima de la dilución de corte (cut off) donde se puede distinguir perfectamente un patrón fluorescente. Es muy importante recordar que un resultado positivo no implica enfermedad, pudiendo ocurrir en individuos adultos sanos. Por lo tanto el resultado debe ser interpretado en el contexto clínico de cada paciente.
Por último hay que tener en cuenta:
• La edad y el género del paciente.
• La ingesta de drogas que provoquen LES inducido, como por ej: Hidralazina.
• El título obtenido.
• El patrón inmunofluorescente. Estos patrones pueden cambiar cuando se leen a diferentes diluciones.
Debe ser reportada la presencia de más de un patrón con sus respectivos títulos.
• Tener en cuenta los criterios diagnósticos de enfermedades reumáticas sistémicas.
• La posibilidad de la presencia de autoanticuerpos como fenómenos paraneoplásicos, como puede ocurrir en el cáncer de mama.
• La posibilidad de la presencia de enfermedades infecciosas, como por ejemplo suele ocurrir en la lepra o pacientes HIV positivos.
La naturaleza técnica de estas pruebas, la falta de estandarización, la dificultad en la obtención de patrones primarios, la observación subjetiva de los resultados, la utilización de diferentes microscopios, crean problemas singulares a la hora de establecer un programa de control de la calidad. Sólo una gran preocupación en la validez, exactitud y reproducibilidad de la técnica, usando sueros de referencia para la titulación del conjugado, estableciendo un control de calidad interno y participando en programas de control externo de la calidad, se conseguirán resultados más confiables y habrá mayor acuerdo entre los laboratorios.
Esto será apreciado por médicos y redundará en el beneficio de los pacientes.
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